血小板黏附到受損的血管壁上,是止血與血栓形成中的重要過程。血管性血友病因子(VonWillebrandFactor,VWF)與血小板受體GPIbα間的相互作用,介導著血小板的附著黏附以及滾動黏附過程,在血小板初始黏附階段起著非常重要的作用。

VWF的活性與其分子大小有關,分子量越大,其活性越強。血管性血友病因子水解蛋白酶ADAMTS13(Adisintegrinandmetalloproteasewithathrombospondintype1motifs13)通過酶切VWF-A2結構域中心的Tyr1605-Met1606肽鍵,對VWF的大小進行調節,從而調節VWF的活性。目前有研究表明ADAMTS13存在低親和力的閉合構象和高親和力的打開構象；ADAMTS13中的spacer結構域中5個特定的位點發生突變(R568K/F592Y/R660K/Y661F/Y665F),稱之為功能增強型突變體(GOF),其酶切活性相較WT增加約2.5倍；此外,低pH可以增強ADAMTS13的活性,Ca~(2+),Mg~(2+),Zn~(2+)等二價金屬離子亦可調節ADAMTS13酶切VWF-A2的活性。ADAMTS13在上述各種條件下的酶切活性的變化是否是與其自身的構象發生變化有關?ADAMTS13分子是否存在多種構象,低pH是否誘導ADAMTS13構象發生改變,以及二價金屬離子是否會影響ADAMTS13構象?

本研究利用原子力顯微鏡AFM分別對不同條件下WT-ADAMTS13及GOF-ADAMTS13進行形態學掃描。數據顯示,不同條件下,WT-ADAMTS13和GOF-ADAMTS13的體積(Volume)、投影面積(ProjectedArea)、最長徑(Maximumlength)相比,區別并不明顯。但是,WT-ADAMTS13蛋白顆粒的縱橫比值(AspectRatio)顯著性地小于GOF-ADAMTS13的縱橫比。對縱橫比數據進行柱狀圖分布并進行高斯函數擬合,WT-ADAMTS13的縱橫比呈雙峰分布,GOF-ADAMTS13的縱橫比呈三峰分布。我們將每個峰定義為不同的類型(stateI,stateII,stateIII),我們提出stateI是“封閉”的構象,stateIII是“開放”的構象,stateII是中間態構象。數據顯示,在pH6和pH7.5條件下,WT-ADAMTS13采用兩種不同的構象狀態(stateI,stateII),而在GOF-ADAMTS13中觀察到另外一種狀態(stateIII)。與pH7.5相比,WT-ADAMTS13的stateII和GOF-ADAMTS13的stateIII的百分比在pH6增加,WT-ADAMTS13的stateI和GOF-ADAMTS13的stateI和stateII降低,表明低pH可以誘導ADAMTS13呈現更加開放的構象。當用EDTA螯合金屬離子后,ADAMTS13stateII和stateIII兩種構象分布明顯增加,而對GOF的構象分布影響不大。當再次加入不同的二價離子,我們發現,加Ca~(2+),Mg~(2+)后,WT-ADAMTS13的stateI明顯增加,構象變得更為緊湊；GOF在加入Mg~(2+)后,stateI亦明顯增加,說明Ca~(2+),Mg~(2+)可以穩定ADAMTS13的構象；Zn~(2+)對兩種蛋白的構象均無影響,說明Zn~(2+)并不是通過影響ADAMTS13的構象而使其活性發生變化。

本研究通過對不同條件下ADAMTS13的構象數據進行統計分析,歸納提出ADAMTS13存在3種構象狀態,更加清晰的闡明了ADAMTS13在不同條件下發揮酶切活性時存在的多種構象,且ADAMTS13的構象受二價金屬離子調控,這些發現進一步加深了我們對ADAMTS13水解VWF,調控其活性的理解,同時為ADAMTS13相關血栓疾病的理解及抗血栓藥物的研發提供指導意義。
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